一种CRISPR/Cas9系统介导的小麦多基因敲除编辑体系

摘要：

小麦(Triticum aestivum L.)是世界上重要的粮食作物,其安全生产关系到我国乃至世界的粮食安全.培育高产,优质,多抗和资源高效利用的小麦新品种,一直是育种家们的育种目标.但由于小麦基因功能冗余及多倍体特性,利用常规育种方法,在一个小麦品种中聚合多基因位点所赋予的几个重要农艺性状是非常具有挑战性的.近年来,CRISPR/Cas9技术作为一种简单,通用,高效的基因编辑工具,被广泛地应用于作物功能基因组学研究及遗传育种改良.因此利用该技术建立高效的小麦多基因编辑体系,将促进小麦基础分子生物学研究和多基因控制复杂性状的网络解析,定向改良小麦多优良农艺性状,加速小麦育种进程.本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和内源性t RNA处理系统,建立了一种高效且通用的小麦多基因编辑体系.以Ta Qsd1,Ta NPT1,Ta IPA1,Ta ARE1,Ta SBEⅡa和Ta SPDT六个基因为靶标基因,分别构建同时靶向2个,3个,4个和5个基因组合的小麦多基因编辑载体;采用基因枪法转化郑麦7698小麦幼胚,经小麦植物组织培养获得再生植株;利用Hi-Tom试剂盒和基因组特异性引物扩增PCR产物测序方法进行基因型鉴定;进一步预测靶序列脱靶位点,利用特异性引物扩增测序,对编辑株系进行脱靶分析;利用dd PCR方法评估T_0代编辑植株转基因拷贝数;通过组培扩繁及后代基因型鉴定,对T_1代编辑株系进行遗传学分析.研究结果如下:1,建立了一种高效,通用的小麦多基因编辑体系:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,成功地建立了以Pol II型启动子Actin启动表达多个串联重复的t RNA-g RNA单元,并添加具有增强转录本稳定性的Poly A序列和Nos终止子终止表达的小麦多基因编辑体系.利用该体系成功地在优质小麦品种郑麦7698中实现同时靶向2个,3个,4个和5个基因的敲除编辑,同时编辑效率最高可达50%.2,脱靶分析:在小麦六个靶标基因中,个别株系检测到Ta SPDT基因预测脱靶位点1和Ta IPA1基因预测脱靶位点1中出现了脱靶情况,其他预测脱靶位点均无脱靶情况发生.3,转基因拷贝数分析:实验结果显示,在获得的19株T_0代编辑植株中,Cas9转基因拷贝数在1到9之间,hpt II转基因拷贝数在1-8之间.Cas9拷贝数和编辑效率无直接相关,但Cas9拷贝数越多,获得共编辑位点的可能性越大.4,获得无转基因并且聚合多种目标基因新变异的小麦新材料:通过小麦组培扩繁及后代分离,在一年内成功获得了无转基因并且多种目标基因新变异的小麦新材料.后代遗传学分析结果表明,除了个别基因在T_1代部分编辑植株中出现了新的编辑类型,大多数编辑位点能够遗传到下一代,并符合孟德尔遗传分离定律.

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